Actividades

1

Producción de ingredientes

Fabricación de los ingredientes a base de hongos y microalgas durante toda la ejecución del proyecto.

2

Cribado in vitro de los hongos y microalgas

Selección de los ingredientes a incorporar en el pienso en base a su capacidad antimicrobiana, inmunomoduladora y antiinflamatoria

3

Producción de pienso y evaluación de efectos funcionales

Obtención y selección de piensos a escala piloto y cálculo de las cantidades necesarias de cada ingrediente para mantener su eficacia.

4

Simulación de la digestión gastrointestinal aviar

Selección de piensos formulados con los ingredientes que, tras simular el proceso de digestión aviar, muestran mayor capacidad antimicrobiana, inmunomoduladora y/o antiinflamatoria.

5

Caracterización analítica

Caracterización analítica. Caracterización analítica de los ingredientes y piensos seleccionados in vitro por su mayor eficacia.

6

Evaluación in vivo en granja experimental

Evaluación de los piensos en una granja experimental: controles productivos, epidemiológicos, clínicos, de patógenos en heces y del estado del sistema inmunitario.

RESULTADOS

Producción de ingredientes

Se llevó a cabo un exhaustivo proceso de revisión bibliográfica, tanto externa como propia, para comprobar la eficacia teórica de los productos a base de hongos y microalgas aplicados en animales avícolas. Este punto también tiene un impacto directo en la formulación de los núcleos y en su dosificación, ya que se han determinado las especies de hongos y microalgas más adecuadas, así como su formato y dosificación.

Una vez seleccionadas aquellas especies que, por bibliografía, demostraron tener un mayor potencial antimicrobiano, inmunomodulador y/o antiinflamatorio, se comenzó con la producción a escala piloto de los hongos y las microalgas, con el fin de generar la cantidad suficiente de estos ingredientes como para dar comienzo a los ensayos in vitro. Asimismo, se optimizó el proceso de generación de compuestos de interés y su preparación para las pruebas en laboratorio.

Fotobiorreactor tubular con un cultivo de C. vulgaris a baja intensidad de luz.

El proceso de escalado comenzó una vez se obtuvieron los primeros resultados preliminares. Estos arrojaron que la microalga con mayor potencial era la Chlorella vulgaris (Cv) y dos muestras de hongos, elaboradas a partir de los núcleos de “seta de ostra” (P. ostreatus), “reishi” (G. lucidum) y “shiitake” (L. edodes). Por tanto, se escaló la producción de estas especies, aumentando la eficiencia en un proceso de mejora continua, teniendo en cuenta una correcta preservación, mantenimiento y trazabilidad.

Cribado "in vitro" de hongos y microalgas

Los primeros ensayos in vitro de los ingredientes y sus combinaciones, se realizaron con un total de 5 muestras de 90g de microalgas y 5 muestras de 100g de hongos.

Efecto antimicrobiano

En primer lugar, se llevó a cabo una selección de las cepas de interés para que actúen de diana en los diferentes ensayos. Los principales patógenos de interés en avicultura pueden clasificarse en varios grupos: bacteriófagos, víricos, hongos y otros (principalmente parásitos). Teniendo en cuenta las que presentan mayor relevancia en campo o con mayor relación con zoonosis, se seleccionaron como patógenos de interés E. coli, Campylobacter y Salmonella, procedentes tanto de recursos biológicos y genéticos propios como de muestras de campo.

Para determinar la capacidad antimicrobiana de los mismos, se realizaron pruebas in vitro empleando medios de cultivo para diagnosticar el grado de inhibición que los extractos ejercen sobre los microorganismos diana, y en su caso poder determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI). Se utilizaron para ello dos técnicas de análisis: método ecométrico y método de turbidez.

No ha sido detectada actividad antimicrobiana en ninguno de los ingredientes evaluados.

Efecto inmunomodulador y antiinflamatorio

Los macrófagos son las células del sistema inmunitario que orquestan la respuesta innata y adaptativa ante una perturbación, siendo las más evaluadas en ensayos in vitro. Por otro lado, las citoquinas son los factores humorales que producen la respuesta inmunológica, actuando fundamentalmente como reguladores de las respuestas inmunitaria e inflamatoria. En el caso de los ensayos MICOALGA-FEED, estos se realizaron sobre la línea celular de macrófagos aviares HD11, siendo las citoquinas de interés las siguientes: IL-1β, IL-6 e IL-10.

Por otro lado, las aves están expuestas constantemente a un gran número de microorganismos, algunos de ellos patógenos y otros propios de la flora. Por ello, las células de defensa que entren en contacto con el pienso MICOALGA-FEED estarán, según el estado del ave en ese momento, activas o inactivas. Es, por tanto, fundamental evaluar el efecto dual.

Cuando los macrófagos están inactivos se evalúa el efecto inmunoestimulante: un aumento en la concentración de citoquinas IL-1β e IL-6 tras la adición de los ingredientes, significa un efecto inmunoestimulante, puesto que prepara a los macrófagos frente a las amenazas.

Por el contrario, cuando el macrófago está activo, se evalúa el efecto antiinflamatorio: una disminución de la concentración de citoquinas, implica un efecto antiinflamatorio, puesto que reduce la inflamación.

Sin embargo, antes de evaluar el efecto funcional de los productos, es necesario conocer su biocompatibilidad con la línea celular HD11. Tras realizar este análisis se observa que la concentración máxima biocompatible de microalgas es de 250 ug/mL. Por su parte, la concentración máxima biocompatible de hongos es de 500 ug/mL. Con el fin de obtener resultados comparables entre hongos y microalgas, la evaluación del efecto inmunomodulador y antiinflamatorio se ha realizado con una concentración de 250 ug/mL.

Como se comentó anteriormente, para valorar el efecto inmunomodulador de los ingredientes, las células HD11 (macrófagos aviares) están “inactivos” y son tratados con las muestras de interés.

En el caso de los hongos, todas las muestras proporcionadas han demostrado poseer un efecto inmunomodulador, al incrementar de una forma estadísticamente significativa las citoquinas IL-1β e IL-6.

En cuanto a las microalgas, todas excepto 1 han demostrado ese efecto inmunoestimulante.

En cuanto a la capacidad antiinflamatoria, al contrario que en el caso anterior,  las células HD11 (macrófagos aviares) se exponen a un activador que incrementa la expresión de citoquinas proinflamatorias en estas células y simula un contexto inflamatorio. A continuación, se incorporan las muestras de hongos y microalgas para evaluar la disminución de estas citoquinas, que conlleva una reducción de la inflamación y por tanto un efecto antiinflamatorio de las muestras.

Ha sido detectado un efecto antiinflamatorio en las muestras M1 y M4 de los hongos y en la muestra Cv de las microalgas.

A modo de resumen, como se observa en las tablas de la derecha, todas las muestras de hongos han demostrado un efecto inmunoestimulante en las células de defensa inactivas. Además, las muestras M1 y M4 muestran un efecto antiinflamatorio cuando las células de defensa están activadas. Por tanto, M1 y M4 son las muestras de mayor interés por su doble capacidad.

Tabla 1. Resumen del efecto inmunomodulador y antiinflamatorio, respectivamente, de las muestras de hongos.

Tabla 2. Resumen del efecto inmunomodulador y antiinflamatorio, respectivamente, de las muestras de microalgas.

Por su parte, las muestras de microalgas poseen un efecto inmunoestimulante en las células de defensa inactivas. Cuando estas últimas están activadas, únicamente la muestra Cv (a una concentración de 50 ug/mL), ha demostrado un efecto antiinflamatorio. Por tanto, la muestra de Cv es la de mayor interés.

En base a estos resultados, se optó por evaluar la capacidad inmunomoduladora y antiinflamatoria de la combinación del hongo M1 y la microalga Cv, y de la combinación del hongo M4 con Cv. Finalmente, los resultados más satisfactorios fueron para la primera combinación (M1 + Cv). Asimismo, estos estudios in vitro mostraron que se debe incluir 5 veces más ingrediente de hongo M1 que de microalga Cv para tener una combinación efectiva en los 2 escenarios evaluados.

Producción de piensos y evaluación de los efectos funcionales

Se desarrollaron piensos a los que se incorporó la muestra Cv de microalgas, la M1 de hongos y una combinación de ambas, además del pienso control. Estos 4 piensos se duplicaron para incorporar dos correctores salinos diferentes, haciendo un total de 8 piensos MICOALGA-FEED, como se recoge a continuación:

Siguiendo el mismo protocolo que en los ingredientes, se hizo un análisis de la capacidad antimicrobiana, inmunomoduladora y antiinflamatoria de los 8 piensos MICOALGA-FEED. La tabla de la izquierda hace referencia a los resultados de los piensos que incluían el corrector salino 1, y la de la derecha el corrector salino 2. En cuanto a la capacidad antimicrobiana, ningún pienso proporcionó resultados positivos.

Simulación de la digestión gastrointestinal aviar

Tan importante es la capacidad de los piensos como de los digeridos obtenidos tras el paso del pienso por el sistema gastrointestinal aviar, pues serán estos últimos los que sean asimilados por el animal. Los digeridos de los piensos se obtuvieron con un simulador de la digestión gastrointestinal aviar que incluye el buche, el estómago y el intestino delgado, que reproduce las condiciones de temperatura, tiempo y pH de cada sección del aparato digestivo.

Ninguno de los digeridos demostró capacidad antimicrobiana. En cuanto a la capacidad inmunomoduladora y antiinflamatoria, los resultados obtenidos se muestran en la siguiente tabla.

Conclusiones de los ensayos "in vitro"

Capacidad antimicrobiana. Los resultados en las condiciones ensayadas no han sido satisfactorios en el caso de los ingredientes y sus combinaciones. Tampoco ha sido posible encontrar actividad antimicrobiana en los piensos formulados ni sus digeridos.

Efecto inmunomodulador. El que mejores resultados in vitro ha demostrado es el que incorpora la combinación de hongos (M1) y microalgas (Cv), ya que muestra un efecto inmunoestimulante tanto en los piensos como en los digeridos, independientemente del corrector salino.

Efecto antiinflamatorio. Ninguno de los piensos formulados ha mostrado un resultado negativo frente a la actividad inmunomoduladora o antiinflamatoria tanto de los piensos como de sus digeridos.

Próximos pasos

En la fase final del proyecto, se llevará a cabo un ensayo in vivo en una granja experimental, mediante el cual se observará la evolución de diferentes parámetros de producción y bienestar animal, así como marcadores serológicos en diversos grupos de pollos de engorde alimentados con piensos convencionales y los piensos funcionales desarrollados en MICOALGA-FEED.